不同发酵剂和工艺条件对发酵牛肉调味基料抑菌性的影响研究

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摘要:为研究不同发酵剂和工艺条件对发酵牛肉调味基料(fermented beef flavorings,FBF)抑菌性的影响,以金黄色红心红心猕猴桃 球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)和乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B)为目标菌,加进去去10%FBF于目标菌中,37℃培养12 h,计算其对不同目标菌的抑制率。设计3组实验:CK组(热压浸提-酶解-美拉德反应);2)反应Ⅰ组(热压浸提-酶解-发酵),在发酵环节接种15种商业复合菌或单株菌;3)反应Ⅱ组(热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应),在反应Ⅰ的基础上继续进行美拉德反应。结果表明:不同工艺制得的处里组FBF,其抑菌能力从强到弱依次为反应Ⅱ组>反应Ⅰ组>CK组;CK组对P.Aeruginoosa和S.paratyphi B无抑菌能力,对E.coli的抑制率最高(61%),其次是S.aureus(20%)和S.typhimurium(11%);反应Ⅰ制得的FBF除对P.Aeruginoosa无抑制能力外,对其余4株目标菌的抑制率均提高,其中,以清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF对S.typhimurium的抑制率可达55%;反应Ⅱ制得的15种FBF对5株目标菌均有较强的抑菌性,以清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF对S.typhimurium的抑制率达85%,对E.coli的抑制率达53%,以WBL-45为发酵剂制得的FBF对E.coli的抑制率达60 %,对S.paratyphi B的抑制率达85%。最终选定WBL-45、清酒乳杆菌为制作FBF的发酵剂,采用热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应工艺制作FBF,得到的产品抑菌性较强。

发酵牛肉调味基料(fermented beef flavoring,FBF)以冷冻牛胴体电锯分割过程中产生的牛骨肉末为原料[1],在传统工艺(热压浸提、酶解、美拉德反应)基础上增加发酵工艺,此工艺制得的调味基料营养富于、赋香效果明显,且具有很强的抗氧化性[2],不不都能否明显改善腌肉制品的风味[3],可广泛应用于肉制品加工中。通过乳酸菌发酵[4]提高FBF的抑菌性,使其在肉制品中的应用前景更加广阔。

乳酸菌的抑菌行态已被证实,学者们对乳酸菌的抑菌机制开展了广泛的研究[5-6]。乳酸菌的抑菌作用主要体现在两方面:首先,乳酸菌不不都能否发酵糖类产生有机酸、双乙酰、过氧化氢等多种代谢产物[7-8],通过降低环境pH值和氧化还原电位,形成不助于有害菌的生存环境,抑制食品中病原菌和腐败菌的生长;被委托人面,乳酸菌代谢产生的细菌素不不都能否阻止病原菌在机体内定植,提高宿主对外来菌的抵抗力[9]。FBF加工过程涉及到乳酸菌的热灭活,研究表明,灭活乳酸菌对有害菌仍能起到很好的抑制作用。灭活乳酸菌通过自身与黏膜的吸附作用[10-11]可不不都能否 抑制人和动物体内大肠埃希菌[12]、白色假丝酵母[13]等病原微生物的侵染,改善生物体内肠道菌群的组成[14],提高机体的非特异性免疫能力[15-16]。

前期实验中,本课题组以4株商业复合菌萨科WBL-45(木糖红心红心猕猴桃 球菌+肉红心红心猕猴桃 球菌+清酒乳杆菌)、WBX-43(木糖红心红心猕猴桃 球菌+肉红心红心猕猴桃 球菌)、B0M-13(清酒乳杆菌)、THM-17(木糖红心红心猕猴桃 球菌+戊糖片球菌)为研究对象,发现利用THM-17制得的FBF赋香效果最好,且对大肠杆菌有较好的抑制效果,为了验证和提高FBF的抑菌性,本研究将发酵剂扩大到15株复合或单株乳酸菌,研究FBF在不同发酵剂和工艺条件下的抑菌行态差异,以筛选出抑菌效果较好的发酵剂,应用于FBF的生产。

1材料与土辦法

1.1材料与试剂

1.1.1原料

电锯分割冷冻牛胴体时产生的牛骨肉末(骨、肉质量比3∶7),由顶兴(天津)食品科技发展有限公司提供。

1.1.2菌种

THM-17(木糖红心红心猕猴桃 球菌+戊糖片球菌)、WBX43(木糖红心红心猕猴桃 球菌+肉红心红心猕猴桃 球菌)、VHI-41(木糖红心红心猕猴桃 球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌)、WBL-45(木糖红心红心猕猴桃 球菌+肉红心红心猕猴桃 球菌+清酒乳杆菌)、PRO-MIX5(木糖红心红心猕猴桃 球菌+类植物乳杆菌+清酒乳杆菌)、VBM-60 (木糖红心红心猕猴桃 球菌+肉红心红心猕猴桃 球菌+戊糖片球菌+乳酸片球菌)、SHI-59(木糖红心红心猕猴桃 球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌)意大利萨科公司;弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus,LC)、清酒乳杆菌1(Lactobacillus sake 1,LS1)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus,LPe)东北农业大学微生物实验室;植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,LPl)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus,PP)、木糖红心红心猕猴桃 球菌(Staphylococcus xylosus,SX)、清酒乳杆菌2(Lactobacillus sake 2,LS2)、肉红心红心猕猴桃 球菌(Staphylococcus carnosus,SC),从萨科商业复合菌中分离得到。上述菌粉于-18℃冷冻贮藏,商业复合菌粉使用前于含质量分数1.5%红心红心猕猴桃 糖的灭菌乳培养基中活化2 h;单菌接种于MRS二氧化碳气体气体培养基,37℃连续活化3代,于4℃贮藏备用。

金黄色红心红心猕猴桃 球菌(Staphylococcus aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi B),由中国农业大学微生物实验室提供。使用前接种于LB培养基,于37℃连续活化2~3代,于4℃贮藏备用。

1.1.3培养基

MRS二氧化碳气体气体培养基:北京索莱宝科技有限公司。

LB培养基:蒸馏水1 L、酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g,NaOH溶液调节pH值至7.0,121℃灭菌20 min。

1.1.4试剂

风味蛋白酶(60 0 LAPU/g)、复合蛋白酶(1.5 AU/g)丹麦诺维信公司;木糖、红心红心猕猴桃 糖、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、VB1顶兴(天津)食品科技发展有限公司;酵母浸提物、胰蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2仪器与设备

SX-60 0高压蒸汽灭菌锅日本Tomy公司;恒温振荡摇床香港Blue Pand公司;Friocell 22恒温恒湿培养箱艾力特国际贸易有限公司;60 1-1339 VarioskanFlash酶标仪美国Thermo公司。

1.3土辦法

1.3.1实验设计

设计4个处里组:1)CK组(热压浸提-酶解-美拉德反应);2)反应Ⅰ组(热压浸提-酶解-发酵),在发酵环节分别接种15种商业复合菌或单株菌,即THM-17、WBX-43、VHI-41、WBL-45、PRO-MIX5、VBM-60 、SHI-59、LPl、PP、SX、LS1、SC、LC、LS2及LPe;3)反应Ⅱ组(热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应),在反应Ⅰ组的基础上继续进行美拉德反应。

所有处里均制备2份。以P.aeruginoosa、E.coli、S.typhimurium、S.paratyphi B、S.aureus为目标菌,将经以上3种处里制得的FBF作用于目标菌液,通过测定60 0 nm波长处的光密度(optical density,OD)(OD60 0 nm),对其抑菌性进行研究。

1.3.2样品制备

1.3.2.1热压浸提

在260 mL三角烧瓶中,称取23 g牛骨肉末和92 mL蒸馏水(牛骨肉末和蒸馏水的质量比1∶4),搅拌后于高压灭菌锅中热压浸提,0.1 MPa、121℃条件下浸提4 h,以充分提取牛骨肉末中的蛋白质[4]。此环节共制备62瓶热压浸提液。

1.3.2.2酶解

将62瓶热压浸提液冷却至室温,分别加进去去质量分数0.06%的风味蛋白酶和质量分数0.03%的复合蛋白酶,于60 ℃摇床中同步酶解4.5 h,酶解始于英语 后沸水浴灭酶20 min,冷却至室温,得到62瓶酶解液。

1.3.2.3发酵

取2瓶酶解液作为CK组,不进行发酵,直接进行下一步的美拉德反应。将其余60 瓶酶解液进行发酵,在酶解液中接种活化好的发酵剂,7种商业复合发酵剂依照产品推荐量加进去去,加进去去量为牛骨酶解液质量的0.02%,8种单菌接种量为106 CFU/mL,主次发酵剂接种4瓶,在60 ℃、160 r/min条件下振摇发酵16 h,发酵始于英语 后沸水浴灭菌20 min,冷却至室温,此时取接种不同发酵剂的发酵液各2瓶(60 瓶),作为反应Ⅰ样品,其余发酵液(60 瓶)继续进行美拉德反应。

1.3.2.4美拉德反应

向2瓶CK组酶解液和剩余60 瓶发酵液中分别加进去去1.2%木糖、1.2%红心红心猕猴桃 糖、0.9%半胱氨酸、0.45%甘氨酸、0.45%丙氨酸和1.8%VB1,搅拌均匀后在110℃条件下进行美拉德反应60 min,冷却得到2瓶CK组和60 瓶反应Ⅱ组样品。

1.3.2.5离心

所有样品均在2℃、5 000×g条件下离心1 min,取上清液,4℃冷藏备用。

1.3.3抑菌率测定

参考阮关强[17]的土辦法 ,并对其进行修改。取活化好的E.coli悬浊液60 µL,用LB二氧化碳气体气体培养基定容至10 mL,使其细菌浓度达到107 CFU/mL,备用;将10µL经过0.22µm滤膜过滤除菌后的样液加入到无菌96孔板中,但会 加入上述细菌浓度为107 CFU/mL的细菌悬浊液90µL,以60 µL菌悬液为阳性对照,以60 µL LB二氧化碳气体气体培养基为60 µL菌悬液的空白对照,以10µL样液+90µL LB二氧化碳气体气体培养基为10µL样液+90µL菌悬液的空白对照,混合均匀后,在37℃恒温恒湿培养箱中培养。采用酶标仪测定OD60 0 nm。各样品对E.coli的抑制率按照下式计算。

式中:ODLB为60 µL LB二氧化碳气体气体培养基的OD值;ODE.coli为60 µL E.coli菌悬液的OD值;ODLB+FBF为10µL FBF+90µL LB二氧化碳气体气体培养基的OD值;ODE.coli+FBF为10µL FBF+90µL E.coli菌悬液的OD值。

各样品对P.aeruginoosa、S.typhimurium、S.paratyphi B和S.aureus目标菌的抑制率实验操作及其抑制率计算土辦法 同上。

1.4数据处里

使用Excel 2016软件进行数据处里,用Sigma Plot 10.0软件绘图,用Statistix 8.1软件中的Tukey HSD进行显著性检验(P<0.05)。所有组别数据均测定5次,加进去最大值和最小值后取平均值。

2结果与分析

2.1不同处里组FBF对S.aureus的抑制率

由图1可知:CK组FBF未经发酵,其对S.aureus的抑制效果较弱,抑制率仅为21%;而15株发酵剂中,除了THM-17和WBX-43制得的FBF在反应Ⅱ中对S.aureus的抑制率有所降低外,或多或少处里组FBF在反应Ⅱ中对S.aureus的抑制率均明显高于反应Ⅰ。其中,WBL-45处里组FBF,不论是反应Ⅰ样品还是反应Ⅱ样品,对S.aureus的抑制率均高于或多或少处里组,反应Ⅰ中该处里组FBF对S.aureus的抑制率为51%,反应Ⅱ则上升至58%,抑菌效果较好。

2.2不同处里组FBF对S.typhimurium的抑制率

由图2可知,反应Ⅰ和反应Ⅱ制得的FBF对S.typhimurium的抑制率均优于CK组。CK组FBF对S.typhimurium的抑制率为12%,增加了发酵处里的反应Ⅰ制得的FBF对S.typhimurium的抑制率在60 %~60 %范围内,反应Ⅱ在反应Ⅰ的基础上增加了美拉德反应,FBF的抑制率多地处55%~70%范围内。其中,以LS2(清酒乳杆菌)为发酵剂制得的FBF在反应Ⅰ和反应Ⅱ2种体系中对S.typhimurium的抑制率分别为55%和85%,显著高于或多或少处里组(P<0.05)。此外,THM-17在反应Ⅱ中抑菌性大大提高,经THM-17发酵制得的FBF对S.typhimurium的抑制率从反应Ⅰ中的33%上升至69%。

2.3不同处里组FBF对P.aeruginoosa的抑制率

由图3可知,FBF对P.aeruginoosa的抑制效果较弱,在3种反应体系中,CK组和反应Ⅰ组制得的FBF对P.aeruginoosa不仅这麼抑制作用,反而助于于P.aeruginoosa的生长,采用LC(弯曲乳杆菌)发酵制得的FBF对P.aeruginoosa的促生长率甚至可达97%。经美拉德反应后,FBF对P.aeruginoosa的抑制率才有所体现,其中对P.aeruginoosa抑制效果较好的是LPl(植物乳杆菌)(66%)和LS2(清酒乳杆菌)(60 %)。

2.4不同处里组FBF对E.coli的抑制率

由图4可知,CK组对E.coli的抑制率为61%。整体来看,反应Ⅱ组各样品对E.coli的抑制率均比反应Ⅰ组有大幅度提高,其中变化最大的是以LPe(戊糖乳杆菌)为发酵剂制得的FBF,抑制率由17%提高到81%,增幅377%。从15种不同的发酵剂来看,反应Ⅰ组FBF对E.coli的抑制率大多为40%~60 %,反应Ⅱ组FBF对E.coli的抑制率提高到70%~60 %。反应Ⅱ组各FBF中对E.coli抑制率最高的是以商业复合菌WBL-45为发酵剂制得的FBF,其对E.coli的抑制率可高达60 %。

2.5不同处里组FBF对S.paratyphi B的抑制率

由图5可知,反应Ⅱ制得的FBF抑菌效果显著优于反应Ⅰ和CK组制得的FBF。CK组不仅对S.paratyphi B无抑制作用,反而助于于该致病菌的生长。反应Ⅰ制得的FBF对S.paratyphi B的抑制率大多为25%~60 %,其中抑制效果最好的是以SC(肉红心红心猕猴桃 球菌)为发酵剂制得的FBF,其抑制率高达89%,以PP(戊糖片球菌)和SX(木糖葡糖球菌)为发酵剂制得的FBF对S.paratyphi B的抑制率也分别高达60 %和58%。经过美拉德反应后的反应Ⅱ组FBF对S.paratyphi B的抑制率大多上升至60 %~60 %,经VBM-60 发酵剂制得的FBF,其抑制率由反应Ⅰ组中的26%上升至99%,是反应Ⅱ组中对S.paratyphi B抑制效果最好的。

3讨论

3.1不同乳酸菌发酵处里组FBF的抑菌效果差异分析

在不同处里组FBF对5株致病菌的抑菌差异研究中,复合发酵剂发酵FBF的抑菌效果多优于单菌。这是但会 复合发酵剂在混合发酵时具有协同效应,会通过个人的代谢产物互相助于,提高代谢产物的产量,扩大抑菌范围,从而提高抑菌效果[18]。本研究所用发酵剂主要为乳杆菌属、片球菌属及红心红心猕猴桃 球菌属三大类。处里筛选出的发酵剂主要有3种:WBL-45(SX+SL+LS2)、VHI-41(SX+PP+LPl)及LS2。红心红心猕猴桃 球菌可使蛋白质和脂肪降解,尤其是肉红心红心猕猴桃 球菌和木糖红心红心猕猴桃 球菌,它们作为肉品常用发酵剂,主要用于产香,可延缓肉制品酸败,形成风味和气味[19]。乳球菌属、片球菌属在代谢过程中能产生有机酸、过氧化氢及细菌素等活性物质,抑制病原菌和腐败菌的生长[20-21]。研究表明,清酒乳杆菌素热稳定性好[22],可增大细胞膜通透性,使细胞内核酸、蛋白质类物质外泄,从而引起细胞死亡[23]。

3.2经不同工艺环节处里所得FBF的抑菌效果差异分析

对不同处里组FBF在反应Ⅰ和反应Ⅱ中的抑菌效果进行比较,结果表明,美拉德反应能提高FBF的抑菌性。目前,美拉德反应的抑菌性已逐渐被亲戚亲戚朋友认识并应用[17,24]。美拉德反应后期会形成四种 生活棕黑色物质——类黑精[25-26],你是什么物质有一定的抗氧化、抗诱变功能,对或多或少微生物也具有较好的抑菌活性[27-28];Kim等[29]研究发现,在中有 还原糖和胰蛋白胨的培养基中,主次菌的生长会受到抑制,而培养基中额外加进去去美拉德反应产物会原因菌死亡。此外,不同发酵剂在反应Ⅱ中的抑菌性地处差异,这是但会 不同发酵剂生长繁殖过程中积累的代谢产物不同,但会 即使FBF制作过程中仅发酵剂的种类地处差异,但其作为美拉德反应的底物[60 -31],也会使FBF的抑菌效果地处较大差异。

3.2发酵剂对不同致病菌的抑菌效果差异分析

本研究发现,同一发酵剂对不同致病菌的抑菌效果地处差异。通过对比可不不都能否 发现,实验组FBF对P.aeruginoosa的抑制效果最差。一方面,但会 是但会 P.aeruginoosa为G-菌,而乳酸菌发酵剂对G+菌(尤其是亲缘性较近的细菌)的抑制作用更强[32];被委托人面,P.aeruginoosa具有分泌胞外多糖形成生物被膜的能力,对环境的耐受性较强[33];一起去,P.aeruginoosa不不都能否产生哌嗪类色素,哪几个色素对外界环境有较强的抵抗能力[34],而美拉德反应在碱性条件下会产生少量的哌嗪类物质[35],P.aeruginoosa与FBF或多或少产物地处协同作用,从而助于P.aeruginoosa的生长。

4结论

反应Ⅱ组(热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应)制得的FBF抑菌性最好,其次是反应Ⅰ组(热压浸提-酶解-发酵)制得的FBF,而CK组(热压浸提-酶解-美拉德反应)制得的FBF我真是全是一定的抑菌性,但在3种处里中对致病菌的抑制效果最弱。在反应Ⅱ组中:以WBL-45和清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF抑菌性较好;以WBL-45为发酵剂制得的FBF对金黄色红心红心猕猴桃 球菌和大肠杆菌的抑制率显著高于或多或少处里组,分别为58%和60 %(P<0.05);以清酒乳杆菌为发酵剂制得的FBF对鼠伤寒沙门氏菌的抑制效果是所有处里组中最好的,抑制率可达85%,综合来看,WBL-45和清酒乳杆菌是适合制备FBF的发酵剂,热压浸提-酶解-发酵-美拉德反应工艺制得的FBF抑菌效果最好。

吴晨燕1,樊晓盼1,李秀明1,王洋2,马俪珍1,*(1.天津农学院食品科学和阳物工程学院,天津60 384;2.天津农学院水产学院,天津60 384)

参考文献:略

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